白蛋白纳米基因载体的制备与表征(1)
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【摘要】 目的 研制白蛋白纳米基因载体，评估白蛋白纳米粒用作基因载体的可行性。方法 采用去溶剂化法制备白蛋白纳米粒，并通过控制转速、pH值、搅拌时间三个变量来考察白蛋白纳米粒的表征变化情况，以PicoGreen荧光法来测白蛋白纳米载体的基因转载率，并用流式细胞仪检测膀胱癌细胞的基因转染率。结果 控制转速1000 RPM，自然状态下的溶液pH值(6.9)，持续搅拌12 h条件下，制得满足基因载体需要的白蛋白纳米粒的平均粒径 (253.1±11.9) nm，zeta电位 (-34.0±4.5) mV，PDI 0.43±0.04，性质相对稳定，基因转载率为(97.61±0.06)%，转染率为(48.21±5.94)%。结论 单纯质粒很难进入细胞核高表达，借助白蛋白纳米载体，使高效的基因转染成为可能。白蛋白纳米粒有望被广泛应用为二次基因转载工具。
【关键词】
人血清白蛋白纳米粒；基因载体；纳米粒
基金项目：广东省科技计划资助项目(项目编号：2009B060700099)
作者单位：519000珠海，中山大学附属第五医院泌尿外科(李怀富 徐峰 阮国锋 郑浩 郑小青 韦胜威 詹鸣)，妇科(阮国锋)；中山大学附属第三医院皮肤科(李晓欣)
单纯质粒转染肿瘤细胞时，很容易被细胞内各种酶降解，能够进入细胞核进行表达的质粒很少，而白蛋白纳米载体能很好地保护质粒免受细胞内各种酶的降解[1]，从而有效地介导质粒DNA(plasmid DNA, pDNA)与肿瘤细胞DNA的整合，获得重组质粒在肿瘤细胞核内的稳定、持久表达。近10年国内外的研究也确实证实了白蛋白纳米载体是一种良好的非病毒基因投递系统[2-4]，具有结合浓缩DNA及将DNA高效地靶向导入各种细胞的能力[5-6]。
白蛋白纳米粒最初被广泛应用于制备缓释以及控释药物方面研究[7]，研究表明白蛋白纳米粒具有良好的缓释功能，易被生物降解，无生物毒性，从而推动了白蛋白纳米粒用作基因载体的研究[8]。而作为基因载体的白蛋白纳米粒要求粒径相对较小、携带合适的表面电荷，性质相对稳定，制备过程不能引入对目的基因有损伤的物理、化学及生物因素。本研究将详细阐述如何获取满足实验需求的白蛋白纳米基因载体，并进一步评估白蛋白纳米粒用作基因载体的可行性，为将来接下来白蛋白纳米粒用作基因载体转载超抗原SEA基因靶向灌注治疗膀胱癌的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 人血清白蛋白A1653(sigma公司)，50%戊二醛(广州齐云生物技术公司)，无水乙醇(南京化学试剂有限公司)，扫描电镜JSM-6360LV (日本电子)，Zetasizer Nano-ZS90(英国马尔文公司)，SHT型精密数显磁力搅拌电热套(菏泽祥龙电子科技有限公司)，电子天平BP 221S (德国sartorius)，超纯水器MILLI-QB (美国MILLIPORE)，ALLEGRATM 64R(BECKMAN)，漩涡混合仪XW-80A(其林贝尔仪器公司)，人膀胱癌细胞株T24(上海细胞生物研究所)，RPMI 1640(GIBCO公司)，10%小牛血清等。
1.2 制备白蛋白纳米粒(human serum albumin nanoparticles, HSA-NPs)的基本过程：①电子天平精确称取30 mg人血清白蛋白，加入纯水配成5 ml溶液，用漩涡混合仪混匀。②室温(25℃)持续搅拌 (1,000RPM)下，滴加(1 ml/min)无水乙醇6.5 ml。③继续搅拌1 h后，滴加3.34 μl[9] 40%(v/v)戊二醛，室温下持续搅拌过夜(12 h)。④离心(12,500 RPM，55 min，4℃)3次纯化，弃去上清 (pH 6.9)，开盖减压蒸馏，待残存的乙醇挥发后，再加纯水分散沉淀，继续离心(3000 RPM，5 min，4℃)，收集上清即得到白蛋白纳米溶液。⑤ -20℃冰箱保存备用。
1.3 白蛋白纳米粒表征的考察 用纳米力度及Zeta电位分析仪测量白蛋白纳米粒的粒径、zeta电位及PDI。 将白蛋白纳米溶液离心(12,500 RPM，55 min，4℃)后，收集沉淀，用70%乙醇脱水，分别设置高浓度组(50 mg白蛋白纳米粒：50 ml 70%乙醇组)和低浓度组(5 mg白蛋白纳米粒：50 ml 70%乙醇组)，直接滴台，待自然风干后喷金，用扫描电镜观察白蛋白纳米粒的形态及分布特征。
1.4 考察单个变量改变对白蛋白纳米粒表征的影响 制备白蛋白纳米粒过程中，每次仅改变单个变量，其他变量保持不变，考察单个变量改变对白蛋白纳米粒表征的影响。
1.5 考察白蛋白纳米粒的稳定性 将白蛋白纳米溶液在室温下静置保存10 d，对比10 d前后样品的表征、粒径和zeta电位及PDI变化情况。
1.6 基因转载率的测定 白蛋白纳米粒制备起始阶段加入0.1 mg携带超抗原SEA基因的质粒(plasmid SEA, pSEA)，用PicoGreen荧光法[10]测定白蛋白纳米粒的基因转载率，并用公式计算：基因转载率= (使用的SEA基因量-未包封的SEA基因量)/使用的SEA基因量 100%。
1.7 体外膀胱癌细胞培养及转染实验 ①用含10%小牛血清、100 IU/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基，在5%CO2、37℃孵箱中培养膀胱癌细胞，每两天传代1次，取对数生长期的膀胱癌细胞接种于24孔板(2×105个/孔)，加入10% 小牛血清、RPMI1640培养液(含青、链霉素)，于5%CO2、37℃孵箱中培养24 h，细胞达到80%～90% 融合率时即可进行转染实验。②转让前1 h，将24孔板内的培养液全部吸除，更换400 μl含10% 小牛血清的RPMI1640培养液(不含抗生素) ......
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