蜂毒肽在不同溶剂系统中的稳定性研究(1)
[摘要]该实验研究了蜂毒肽在不同溶剂(水、脱氧水、生理盐水、磷酸缓冲盐溶液、50%乙醇、乙醇、丙三醇)中的稳定性，发现蜂毒肽在50%乙醇中较在水、脱氧水、生理盐水、磷酸缓冲盐溶液中稳定，与乙醇、丙三醇相比，可完全溶解蜂毒中的蜂毒肽，故选择50%乙醇作为蜂毒肽短期储备的储存溶剂；考察了蜂毒肽受光照、温度、pH的影响，以及在不同浓度磷酸缓冲盐溶液、不同pH磷酸缓冲盐溶液和大鼠皮肤匀浆液中的稳定性，结果表明蜂毒肽不受光照、温度、pH的影响，在低浓度、低离子强度溶液中降解加快，在磷酸缓冲盐溶液中随着pH升高降解加快，在大鼠皮肤匀浆液中加速了降解，为选择影响蜂毒肽稳定性小的实验条件提供了实验依据。
[关键词]蜂毒肽；离子强度；pH；稳定性
蜂毒肽又称为溶血肽，是蜂毒的最主要成分，是一种碱性蛋白质，约占蜂毒干重的40%～60%[1]，具有抗菌消炎、镇痛、抗辐射、抑制血小板凝集、抗艾滋病病毒等多种药理学作用[2-3]，治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎有良好的效果[4]。目前，蜂毒肽在稳定性方面没有相关文献报道，影响其稳定性的因素亦不明确，在制剂过程中若不能有效避免影响其稳定性的因素，会造成蜂毒肽不必要的损失与浪费，甚至影响药效。本实验研究了蜂毒肽在不同溶剂、不同pH条件及不同储备环境下的稳定性，选择蜂毒肽的最佳存储条件，保证蜂毒中主要活性成分蜂毒肽的稳定性，同时考察蜂毒肽在不同pH，不同浓度磷酸盐缓冲液(PBS)、PBS及大鼠皮肤匀浆液中的稳定性，为制备稳定的蜂毒肽制剂提供实验依据。
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1材料
LC-20AT高效液相色谱仪(SPD-20AVWD 检测器，四元低压梯度泵，柱温箱，自动进样器；日本岛津公司，LC Solution色谱工作站)；METTLER AE 240 型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；Sartorius BS110S 型电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；蜂毒肽(Sigma公司，纯度89%)，蜂毒(杭州天厨蜜源保健品有限公司)；乙腈(Fisher公司，色谱纯)，纯净水(娃哈哈集团有限公司)，其余所用试剂均为分析纯。
2方法
2.1蜂毒肽含量测定
2.1.1色谱条件Agilent Zorbax 300SB-C8 Analytical HPLC 色谱柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)，流动相乙腈-0.1%三氟乙酸水(40∶60)，检测波长220 nm，流速1.0 mL·min-1；柱温25 ℃；进样量10 μL。
, 百拇医药
2.1.2储备液稳定性试验取适量蜂毒于10 mL量瓶内，加50%乙醇定容，分别放置于室温(储存于透明量瓶，日光下)、室温避光(储存于棕色量瓶)、4，-20 ℃冰箱内，平行2份，测定0，6，12，24，48，72 h蜂毒肽含量，模拟蜂毒储备液在短时间内放置的各种环境条件。
2.1.3标准曲线的制备取蜂毒肽对照品适量，精密称定，加50%乙醇制成每1 mL含蜂毒肽为525 μg的对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.5，1，3，5，7，10，20 μL进样，记录色谱图和峰面积。以峰面积为纵坐标，有效成分的量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=1 948.2X+46 328，r=0.999 9，在0.19～6.35 μg线性关系良好。
2.1.4方法学考察稳定性试验：在线性范围配制对照品溶液，分别于1，2，4，6，8，12 h，取10 μL注入液相色谱仪测定其峰面积，峰面积的RSD 2.1%，表明稳定性良好。
, 百拇医药
精密度试验：取对照品溶液10 μL连续注入液相色谱仪6次测定其峰面积，结果RSD 2.1%，表明在此色谱条件下精密度良好。
重复性试验：取同一批蜂毒样品6份，精密加入50%乙醇5 mL制成蜂毒溶液，取10 μL注入液相色谱仪测定其峰面积，峰面积的RSD 2.6%，表明样品重复性良好。
回收率试验：取已测定含量的蜂毒适量，精密称定，精密加入蜂毒肽对照品溶液。吸取10 μL样品按上述色谱条件测定，结果蜂毒肽的平均回收率为100.1%，RSD 2.6%。
2.2蜂毒肽不同溶剂系统的稳定性研究
2.2.1不同溶剂稳定性取适量的蜂毒于10 mL量瓶内，分别以水、脱氧水、生理盐水、PBS(pH 6.8)、50%乙醇、乙醇、丙三醇为溶剂，平行2份，于室温下放置，测定0，2，4，8，12，24 h的蜂毒肽含量。
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2.2.2不同pH对蜂毒肽酸碱稳定性的研究取适量的蜂毒于10 mL量瓶内，用磷酸盐-50%乙醇溶液(调节溶液pH分别为4.0，6.8，7.4，9.0)定容，平行2份，于室温下放置，测定0，2，4，8，12，24 h的蜂毒肽含量。
2.2.3不同浓度PBS对蜂毒肽稳定性的研究取适量的蜂毒于10 mL量瓶内，分别用0.2，0.01 mol·L-1PBS(pH 6.8)定容，平行2份，于室温下放置，测定0，2，4，8，12，24 h的蜂毒肽含量。
2.2.4不同pH PBS对蜂毒肽稳定性的研究取适量的蜂毒于10 mL量瓶内，用PBS(pH分别为5.0，6.8，7.4，8.0)定容，平行2份，于室温下放置，测定0，2，4，8，12，24 h的蜂毒肽含量。
2.2.5大鼠皮肤对蜂毒肽稳定性的研究分别取0.1，0.5 g大鼠腹部皮肤加适量生理盐水匀浆，取适量的蜂毒于10 mL量瓶内，皮肤匀浆液定容，平行2份，于室温下放置，测定0，2，4，8，12，24 h的蜂毒肽含量。
3结果
降解率=(1-相应时间点蜂毒肽含量/0 h蜂毒肽含量)×100%。
3.1储备液稳定性试验以50%乙醇为溶剂时，蜂毒肽在室温(储存于透明量瓶，日光下)、室温避光(储存于棕色量瓶)，4，-20 ℃冰箱内，搁置72 h，蜂毒肽含量的RSD小于3%，故蜂毒肽在这些储备条件下72 h内稳定(图1)。, 百拇医药(尚可心 白洁 武慧超 陆洋 杜守颖 杨畅 程艳珂)
[关键词]蜂毒肽；离子强度；pH；稳定性
蜂毒肽又称为溶血肽，是蜂毒的最主要成分，是一种碱性蛋白质，约占蜂毒干重的40%～60%[1]，具有抗菌消炎、镇痛、抗辐射、抑制血小板凝集、抗艾滋病病毒等多种药理学作用[2-3]，治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎有良好的效果[4]。目前，蜂毒肽在稳定性方面没有相关文献报道，影响其稳定性的因素亦不明确，在制剂过程中若不能有效避免影响其稳定性的因素，会造成蜂毒肽不必要的损失与浪费，甚至影响药效。本实验研究了蜂毒肽在不同溶剂、不同pH条件及不同储备环境下的稳定性，选择蜂毒肽的最佳存储条件，保证蜂毒中主要活性成分蜂毒肽的稳定性，同时考察蜂毒肽在不同pH，不同浓度磷酸盐缓冲液(PBS)、PBS及大鼠皮肤匀浆液中的稳定性，为制备稳定的蜂毒肽制剂提供实验依据。
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LC-20AT高效液相色谱仪(SPD-20AVWD 检测器，四元低压梯度泵，柱温箱，自动进样器；日本岛津公司，LC Solution色谱工作站)；METTLER AE 240 型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；Sartorius BS110S 型电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；蜂毒肽(Sigma公司，纯度89%)，蜂毒(杭州天厨蜜源保健品有限公司)；乙腈(Fisher公司，色谱纯)，纯净水(娃哈哈集团有限公司)，其余所用试剂均为分析纯。
2方法
2.1蜂毒肽含量测定
2.1.1色谱条件Agilent Zorbax 300SB-C8 Analytical HPLC 色谱柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)，流动相乙腈-0.1%三氟乙酸水(40∶60)，检测波长220 nm，流速1.0 mL·min-1；柱温25 ℃；进样量10 μL。
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2.1.2储备液稳定性试验取适量蜂毒于10 mL量瓶内，加50%乙醇定容，分别放置于室温(储存于透明量瓶，日光下)、室温避光(储存于棕色量瓶)、4，-20 ℃冰箱内，平行2份，测定0，6，12，24，48，72 h蜂毒肽含量，模拟蜂毒储备液在短时间内放置的各种环境条件。
2.1.3标准曲线的制备取蜂毒肽对照品适量，精密称定，加50%乙醇制成每1 mL含蜂毒肽为525 μg的对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.5，1，3，5，7，10，20 μL进样，记录色谱图和峰面积。以峰面积为纵坐标，有效成分的量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=1 948.2X+46 328，r=0.999 9，在0.19～6.35 μg线性关系良好。
2.1.4方法学考察稳定性试验：在线性范围配制对照品溶液，分别于1，2，4，6，8，12 h，取10 μL注入液相色谱仪测定其峰面积，峰面积的RSD 2.1%，表明稳定性良好。
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精密度试验：取对照品溶液10 μL连续注入液相色谱仪6次测定其峰面积，结果RSD 2.1%，表明在此色谱条件下精密度良好。
重复性试验：取同一批蜂毒样品6份，精密加入50%乙醇5 mL制成蜂毒溶液，取10 μL注入液相色谱仪测定其峰面积，峰面积的RSD 2.6%，表明样品重复性良好。
回收率试验：取已测定含量的蜂毒适量，精密称定，精密加入蜂毒肽对照品溶液。吸取10 μL样品按上述色谱条件测定，结果蜂毒肽的平均回收率为100.1%，RSD 2.6%。
2.2蜂毒肽不同溶剂系统的稳定性研究
2.2.1不同溶剂稳定性取适量的蜂毒于10 mL量瓶内，分别以水、脱氧水、生理盐水、PBS(pH 6.8)、50%乙醇、乙醇、丙三醇为溶剂，平行2份，于室温下放置，测定0，2，4，8，12，24 h的蜂毒肽含量。
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2.2.2不同pH对蜂毒肽酸碱稳定性的研究取适量的蜂毒于10 mL量瓶内，用磷酸盐-50%乙醇溶液(调节溶液pH分别为4.0，6.8，7.4，9.0)定容，平行2份，于室温下放置，测定0，2，4，8，12，24 h的蜂毒肽含量。
2.2.3不同浓度PBS对蜂毒肽稳定性的研究取适量的蜂毒于10 mL量瓶内，分别用0.2，0.01 mol·L-1PBS(pH 6.8)定容，平行2份，于室温下放置，测定0，2，4，8，12，24 h的蜂毒肽含量。
2.2.4不同pH PBS对蜂毒肽稳定性的研究取适量的蜂毒于10 mL量瓶内，用PBS(pH分别为5.0，6.8，7.4，8.0)定容，平行2份，于室温下放置，测定0，2，4，8，12，24 h的蜂毒肽含量。
2.2.5大鼠皮肤对蜂毒肽稳定性的研究分别取0.1，0.5 g大鼠腹部皮肤加适量生理盐水匀浆，取适量的蜂毒于10 mL量瓶内，皮肤匀浆液定容，平行2份，于室温下放置，测定0，2，4，8，12，24 h的蜂毒肽含量。
3结果
降解率=(1-相应时间点蜂毒肽含量/0 h蜂毒肽含量)×100%。
3.1储备液稳定性试验以50%乙醇为溶剂时，蜂毒肽在室温(储存于透明量瓶，日光下)、室温避光(储存于棕色量瓶)，4，-20 ℃冰箱内，搁置72 h，蜂毒肽含量的RSD小于3%，故蜂毒肽在这些储备条件下72 h内稳定(图1)。, 百拇医药(尚可心 白洁 武慧超 陆洋 杜守颖 杨畅 程艳珂)